Comment « déplier » la protéine de pointe de COVID-19 (et le VAX) la faisant disparaître!

Une étude médicale évaluée par des pairs montre que deux suppléments communs en vente libre se combinent pour détruire la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. Cet article réimprime l’étude évaluée par des pairs et vous indique quels suppléments ILS ont utilisés pour éliminer la protéine de pointe. Peut-être que les gens qui ont pris les « vaccins » peuvent l’utiliser pour éliminer les protéines de pointe à l’intérieur d’eux-mêmes, qui rendent beaucoup d’entre eux malades et en tuent beaucoup d’autres? Dans l’intérêt d’une divulgation complète, je ne vends aucun des suppléments mentionnés ici et ne gagne AUCUN ARGENT de qui que ce soit, pour vous transmettre cette information. Je le fais en tant que service public. Cet article évalué par des pairs a été publié en mars 2021, mais personne dans les médias n’a pris la peine de le dire au public. La seule chose que les médias ont faite, c’est pousser le « vax ». Maintenant, beaucoup de gens sont morts, mourants ou très malades à cause du vax. Il semble que l’ARN messager dans le vax, amène nos cellules humaines à « exprimer une protéine de pointe » comme celle sur le coronavirus qui cause COVID. Sauf que les cellules humaines ne sont pas __supposed__ pour « exprimer une protéine de pointe ». La combinaison de bromélaïne et d’acétylcystéine (BromAc) inactive de manière synergique le SARS-CoV-2 1. Department of Surgery, St. George Hospital, Sydney, NSW 2217, Australie 2. Mucpharm Pty Ltd., Sydney, NSW 2217, Australie 3. CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Team VirPatH, Univ Lyon, Inserm, U1111, Université Claude Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, ENS de Lyon, F-69007 Lyon, France 4. Hospices Civils de Lyon, EMR 3738 (CICLY), Lyon 1 Université, F-69921 Lyon, France 5. St. George & Sutherland Clinical School, Université de Nouvelle-Galles du Sud, Sydney, NSW 2217, Australie 6.Laboratoire de Virologie, Institut des Agents Infectieux (IAI), Hospices Civils de Lyon, Groupement Hospitalier Nord, F-69004 Lyon, France Auteur à qui la correspondance doit être adressée. Ces auteurs ont également contribué à ce travail. Ces auteurs ont également contribué à ce travail. Virus 2021, 13(3), 425; https://doi.org/10.3390/v13030425 Reçu: 31 janvier 2021 / Révisé: 25 février 2021 / Accepté: 1 mars 2021 / Publié: 6 mars 2021 (Cet article appartient au numéro spécial Vaccins et thérapeutiques contre les coronavirus) 1. Introduction Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) récemment apparu est l’agent causal de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), qui peut aller de formes asymptomatiques à des formes sévères et mortelles avec un syndrome de réponse inflammatoire systémique. Au 21 février 2021, plus de 111 millions de cas confirmés avaient été notifiés, avec une mortalité globale estimée à 2,2 %. Il existe actuellement peu d’agents thérapeutiques dont l’efficacité a été prouvée pour réduire la progression de la maladie à un stade précoce et avancé. Bien qu’il existe heureusement de nombreux candidats vaccins, leur disponibilité généralisée pour la vaccination peut ne pas être immédiate, la durée de la protection immunitaire peut être limitée et l’efficacité des vaccins peut être réduite par de nouvelles variantes du SRAS-CoV-2. L’exploration continue de traitements efficaces est donc encore nécessaire. Structurellement, le SRAS-CoV-2 contient des protéines de pointe, des protéines membranaires et des protéines d’enveloppe, ainsi que des nucléoprotéines internes qui emballent l’ARN. La protéine de pointe est un complexe de glycoprotéines homotrimères avec différents rôles accomplis par des modifications conformationnelles dynamiques, basées en partie sur des liaisons disulfure. Il permet l’infection des cellules cibles en se liant aux récepteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine (ACE2), entre autres, ce qui déclenche la protéolyse par la sérine protéase transmembranaire 2 (TMPRSS2), la furine et peut-être d’autres protéases, conduisant à la fusion du virion et de la membrane des cellules hôtes. L’entrée de virus dans les cellules de mammifères, ou « internalisation virale », est un mécanisme clé de l’infection virale enveloppée et repose sur des changements conformationnels dynamiques de leurs glycoprotéines de surface, à savoir, médiés par la réduction de la liaison disulfure et régulés par les oxydoréductases et les protéases de surface cellulaire. Il a été démontré que l’entrée du SARS-CoV-2 dans les cellules hôtes commence par la déstabilisation de la protéine de pointe par transition mécanique allostérique, ce qui induit un changement conformationnel de l’état fermé « bas » à l’état « haut » ouvert du domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine de pointe. Les changements conformationnels du RBD et la liaison virale sont induits par TMPRSS2 ou Cathepsin L, qui déclenchent la transition de l’état pré-fusion à l’état post-fusion. L’énergie libérée par la réduction de la liaison disulfure augmente la flexibilité des protéines, qui est maximale lorsque l’état réduit est complet, permettant ainsi la fusion des membranes hôte-virus, ce qui est autrement impossible en raison des forces d’hydratation répulsives présentes avant la réduction. La bromélaïne est extraite principalement de la tige de la plante d’ananas (Ananas comosus) et contient un certain nombre d’enzymes qui lui donnent la capacité d’hydrolyser les liaisons glycosidiques dans les glucides complexes. Des études antérieures ont indiqué que la bromélaïne élimine les protéines de pointe et d’hémagglutinine du virus de la forêt de Semliki, du virus Sindbis, du coronavirus gastro-intestinal de souris, du virus de l’encéphalomyélite hémagglutinante et des virus de la grippe H1N1. En tant que molécule thérapeutique, elle est utilisée pour les brûlures de débridage. L’acétylcystéine est un puissant antioxydant qui est généralement nébulisé dans les voies respiratoires pour l’accumulation de mucus et est également utilisé comme agent hépatoprotecteur en cas de surdosage de paracétamol. Plus important encore dans le contexte actuel, l’acétylcystéine réduit les liaisons disulfure. De plus, l’association des protéines de pointe et d’enveloppe par leurs motifs triples respectifs de cystéine justifie l’hypothèse d’un impact sur la stabilité du virion suite à une rupture du pont disulfure par l’action de l’acétylcystéine. La combinaison de bromélaïne et d’acétylcystéine (BromAc) présente un effet mucolytique synergique qui est utilisé dans le traitement des tumeurs mucineuses et comme chimiosensibilisant de plusieurs médicaments anticancéreux. Ces différentes actions sont dues à la capacité de BromAc à déplier les structures moléculaires de glycoprotéines complexes, permettant ainsi la liaison en raison de la forte affinité entre RBD et ACE2. Par conséquent, dans la présente étude, nous avons cherché à déterminer si BromAc peut perturber l’intégrité des protéines de pointe et d’enveloppe du SRAS-CoV-2 et à examiner ensuite son potentiel d’inactivation contre la réplication in vitro de deux souches virales, dont une avec une altération mutante du nouveau site de clivage S1/S2. 2. Matériaux et méthodes 2.1. Matériaux La bromélaïne API a été fabriquée par Mucpharm Pty Ltd (Kogarah, Australie) sous forme de poudre stérile. Acetylcysteine a été acheté auprès de Link Pharma (Cat# AUST R 170803; Warriewood, Australie). La protéine de pointe recombinante du SRAS-COV-2 a été obtenue à partir de SinoBiological (Cat# 40589-V08B1; Pékin, Chine). La protéine d’enveloppe recombinante a été obtenue à partir de MyBioSource (Cat# MBS8309649; San Diego, Californie, États-Unis). Tous les autres réactifs provenaient de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). 2.2. Électrophorèse recombinante à pointe et gel d’enveloppe Les protéines de pointe ou d’enveloppe ont été reconstituées dans de l’eau distillée stérile conformément aux instructions du fabricant, et les aliquotes ont été congelées à −20 °C. Deux microgrammes et demi de protéine de pointe ou d’enveloppe ont été incubés avec 50 ou 100 μg/mL de bromélaïne, 20 mg/mL d’acétylcystéine, ou une combinaison des deux dans de l’eau Milli-Q. Le témoin ne contenait aucune drogue. Le volume total de réaction était de 15 μL chacun. Après 30 minutes d’incubation à 37 °C, 5 μL de tampon échantillon ont été ajoutés à chaque réaction. Au total, 20 μL de chaque réaction ont été électrophorés sur une page SDS (Cat# 456-1095; Bio-Rad Hercules, CA, États-Unis). Les gels ont été colorés au bleu de Coomassie. 2.3. Détection spectrale UV des liaisons disulfure dans les protéines de pointe et d’enveloppe La méthode d’Iyer et Klee pour la mesure du taux de réduction des liaisons disulfure a été utilisée pour détecter les liaisons disulfure dans les protéines de pointe et d’enveloppe. La protéine de pointe recombinante du SRAS-CoV-2 à une concentration de 3,0 μg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,0) contenant 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) a été incubée avec 0, 10, 20, 40 et 50 μL d’acétylcystéine (0,5 M), agitée à 37 °C pendant 30 minutes, suivie d’une addition équivalente de dithiothréitol (DTT) (0,5 M) et agitée pendant 30 minutes supplémentaires à 37 °C. La protéine de pointe a été incubée en parallèle uniquement avec du DTT (0,5 M) comme auparavant sans acétylcystéine et agitée à 37 °C pendant 30 min. L’absorbance a ensuite été lue à 310 nm. La détection spectrale UV des liaisons disulfure dans la protéine d’enveloppe a été réalisée de manière similaire. 2.4. Inactivation du virus entier du SRAS-CoV-2 avec BromAc Respectant pleinement les directives provisoires de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) en matière de biosécurité liées à la maladie à coronavirus, les tests d’inactivation du virus entier du SRAS-CoV-2 ont été effectués avec une souche de type sauvage (WT) représentative des virus européens en circulation précoce (numéro d’adhésion GISAID EPI_ISL_578176). Une deuxième souche du SARS-CoV-2 (notée ∆S), signalée dans le cadre d’une surveillance génomique de routine dans la région Auvergne-Rhône-Alpes en France, a été ajoutée aux tests d’inactivation en raison d’une mutation rare dans le site de clivage du pic S1/S2 et de sa disponibilité en culture en laboratoire (numéro d’adhésion GISAID EPI_ISL_578177). Ces essais ont été effectués avec des concentrations incrémentielles de bromélaïne seule (0, 25, 50, 100 et 250 μg/mL), d’acétylcystéine seule (20 mg/mL) et la réaction croisée des différentes concentrations de bromélaïne combinée à une formulation constante d’acétylcystéine de 20 mg/mL, contre deux dilutions de culture virale à 10 5,5 et 104,5 TCID50/mL. Après 1 h d’exposition au médicament à 37 °C, toutes les conditions, y compris le témoin, ont été diluées 100 fois pour éviter la cytotoxicité, inoculées en quadruple sur des cellules Vero confluentes (CCL-81; ATCC,© Manassas, VA, USA) et incubé pendant 5 jours à 36 °C avec 5% de CO2. Les cellules ont été maintenues dans le milieu essentiel minimal (EMEM) d’Eagle avec 2% de pénicilline-streptomycine, 1% de L-glutamine et 2% de sérum bovin fœtal inactivé. Les résultats ont été obtenus par des observations quotidiennes en microscopie optique, un test de coloration des cellules terminales et une réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-PCR) d’extraits d’ARN surnageant. En bref, le test de coloration de la lyse cellulaire au point final consistait à ajouter du colorant rouge neutre (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) aux monocouches cellulaires, à incuber à 37 °C pendant 45 min, à laver avec du PBS et à ajouter de l’éthanol citrate avant que la densité optique (DO) ne soit mesurée à 540 nm (Labsystems Multiskan Ascent Reader, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). La DO était directement proportionnelle aux cellules viables, de sorte qu’une faible DO signifierait une lyse cellulaire importante due à la réplication du virus. De plus, l’ARN des surnageants de puits a été extrait par la station de travail semi-automatisée eMAG® (bioMérieux, Lyon, FR), et la RT-PCR Pasteur RT-PCR de l’Institut RdRp RdRp du SARS-CoV-2 a été réalisée sur un système QuantStudio™ 5 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA, USA). Les valeurs de réduction logarithmique10 (LRV) de la réplication virale ont été calculées en divisant la différence entre les puits de traitement et de contrôle par 3,3 (comme 1 log10 ≈ 3,3 seuils du cycle de PCR (Ct)). 2.5. Cinétique de réplication par analyse cellulaire en temps réel Pour comparer la capacité de réplication in vitro des souches de SARS-CoV-2 WT et ∆S, la cinétique de réplication a été déterminée en mesurant l’impédance des électrodes des capteurs cellulaires microélectroniques sur l’instrument DP xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (RTCA) (ACEA Biosciences, Inc., San Diego, CA, États-Unis). Les cellules Vero ont été ensemencées à 20 000 cellules par puits sur une plaque E 16 (ACEA Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA) et incubées avec les mêmes conditions de milieu que celles décrites précédemment à 36 °C avec 5% de CO2. Après 24 heures, des isolats de culture du SARS-CoV-2 ont été inoculés en trois exemplaires à une multiplicité d’infection de 10−2. Des infections simulées ont été réalisées en quadruplicate. Les données d’impédance électronique (indice de cellule) ont été collectées en continu à des intervalles de 15 minutes pendant 6 jours. L’analyse de l’aire sous la courbe de l’indice cellulaire normalisé, établi au moment de l’inoculation, a ensuite été calculée à des intervalles de 12 heures. À chaque intervalle, la viabilité cellulaire a été déterminée en se normalisant par rapport au contrôle cellulaire correspondant. Des tests de comparaison multiples de Tukey ont été utilisés pour comparer chaque condition sur GraphPad Prism (version logicielle 9.0; San Diego, Californie, États-Unis). 3, Résultats 3.1. Altération des pics et des protéines d’enveloppe du SARS-CoV-2 Le traitement de la protéine de pointe avec de l’acétylcystéine seule n’a montré aucune altération de la protéine, tandis que les concentrations de bromélaïne à 50 et 100 μg/mL et de bromAc à 50 et 100 μg/20 mg/mL ont entraîné une altération des protéines (figure 1A). Le traitement par l’acétylcystéine sur la protéine d’enveloppe n’a pas modifié la protéine, tandis que le traitement par bromélaïne à 50 et 100 μg/mL et BromAc à 50 et 100 μg/20 mg/mL Graphique 1. (A) La bromélaïne et l’acétylcystéine présentent un effet synergique sur la déstabilisation des pics et des protéines d’enveloppe du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2). SDS-PAGE des sous-unités recombinantes de la protéine de pointe S1 + S2 du SRAS-CoV-2 (150 kDa) et de la protéine d’enveloppe (25 kDa). Les protéines ont été traitées avec 20 mg/mL d’acétylcystéine seule, 100 et 50 μg/mL de bromélaïne seule, et une combinaison de 100 et 50 μg/20 mg/mL de BromAc. (B) Réduction du disulfure de la protéine de pointe recombinante du SRAS-CoV-2 par l’acétylcystéine. Le dosage différentiel entre l’acétylcystéine (Ac) et le dithiothréitol (DTT) pour la réduction des liaisons disulfure trouvées sur la protéine de pointe indique que l’acétylcystéine réduit 42% des liaisons disulfure avant l’ajout de DTT. Les liaisons restantes sont réduites par DTT pour produire le chromogène détecté à 310 nm. (C) Réduction du disulfure de la protéine d’enveloppe recombinante du SARS-CoV-2 par l’acétylcystéine. Le dosage différentiel entre l’acétylcystéine (Ac) et le dithiothréitol (DTT) pour la réduction des liaisons disulfure trouvées sur la protéine d’enveloppe indique que l’acétylcystéine réduit 40% des liaisons avant l’ajout de DTT. 3.2. La détection spectrale UV démontre l’altération des liaisons disulfure dans les protéines de pointe et d’enveloppe La réduction comparative des liaisons disulfure sur la protéine de pointe entre le DTT seul et le DTT avec l’acétylcystéine a démontré une différence de 42% (Figure 1B), basée sur la pente des graphiques [0,002599/0,006171 (100) = 42%]. L’acétylcystéine a ainsi pu réduire 58% des liaisons disulfure dans l’échantillon, après quoi les liaisons disulfure restantes ont été réduites par DTT pour produire le chromogène qui a été surveillé dans les spectres. De même, le dosage différentiel entre l’acétylcystéine et le DTT pour la réduction des liaisons disulfure trouvées dans la protéine d’enveloppe [0,007866/0,01293 (100) = 60%] indique que l’acétylcystéine réduit 40% des liaisons disulfure avant l’ajout de DTT (Figure 1C). 3.3. Potentiel in vitro d’inactivation du SARS-CoV-2 de la bromélaïne, de l’acétylcystéine et du bromAc Pour les deux souches de SARS-CoV-2 testées, les témoins de virus non traités à 10 5,5 et 104,5 TCID50/mL ont produit des effets cytopathiques typiques (ECP), et aucune cytotoxicité n’a été observée pour aucune des combinaisons de médicaments sur les cellules Vero. Les résultats de l’ECP optique ont invariablement été confirmés par la coloration des cellules rouges neutres au point d’extrémité. Dans l’ensemble, le traitement à la bromélaïne et à l’acétylcystéine seuls n’a montré aucune inhibition virale, tous avec une EPC comparable à celle des puits de contrôle du virus, tandis que les combinaisons BromAc ont montré une inactivation virale d’une manière dépendante de la concentration (Figure 2). Le traitement avec 10 titres de virus TCID 50/mL de 4,5 (figure 2 B,D) a donné une inhibition plus constante de l’ECP pour les quadruplés que pour les titres de virus 105,5 TCID 50/mL (figure 2A,C). Graphique 2. Les tests de lyse cellulaire ont démontré in vitro le potentiel d’inactivation de l’acétylcystéine et de la bromélaïne combinées (BromAc) contre le SARS-CoV-2. La viabilité cellulaire a été mesurée par coloration cellulaire avec du rouge neutre, où la densité optique (DO) est directement proportionnelle aux cellules viables. Un faible OD signifierait une lyse cellulaire importante due à la réplication du virus. La souche SARS-CoV-2 de type sauvage (WT) à 5,5 et 4,5 log10TCID50/mL (A et B, respectivement) n’a montré aucune inhibition de l’effet cytopathique (CPE) pour le traitement en monothérapie, par rapport à la condition de contrôle du virus de traitement simulé. Les combinaisons BromAc ont été en mesure d’inhiber l’EPC, par rapport aux témoins cellulaires d’infection simulés. Le traitement d’une variante de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 (∆S) avec une mutation à la jonction S1/S2 à 5,5 et 4,5 log10TCID50/mL (C et D, respectivement) a donné des résultats similaires. Les barres représentent la moyenne de chaque quadrupliqué par condition, illustrée par des cercles blancs. Une ANOVA unidirectionnelle ordinaire a été réalisée, en utilisant le contrôle du virus de traitement simulé comme condition de contrôle (**** p < 0,0001 , *** p < 0,0005, ** p < 0,003 et * p < 0,05). Sur la base des directives d’inactivation du virus établies par l’OMS, un processus d’inactivation robuste et fiable sera en mesure de réduire la réplication d’au moins 4 logs [valeur de réduction logarithmique 10 (LRV) = (traitement RT-PCR Ct – contrôle RT-PCR Ct)/3,3; comme 1 log10 ≈ 3,3 Ct]. En tant que tel, la RT-PCR a été réalisée sur les extraits d’ARN pour mesurer directement la réplication du virus. Pour la souche de type sauvage (WT) à 104,5 TCID 50/mL, des > 4 LRV réussies ont été observées avec 1 puits sur 4, 2 puits sur 4, 3 puits sur 4 et 4 puits sur 4 pour 25, 50, 100 et 250 μg/20 mg/mL de BromAc, respectivement (figure 3). Il convient de noter qu’à 105,5 TCID 50/mL, le VRL était légèrement inférieur au seuil à 3,3 en moyenne, avec 3 puits sur 4 et 2 puits sur 4 pour 100 et 250 μg/20 mg/mL de BromAc, respectivement (tableau 1). Pour le mutant de la protéine de pointe (∆S) à 104,5 TCID 50/mL, aucun LRV > 4 n’a été observé avec succès pour 25 μg/20 mg/mL de BromAc, mais il a été observé dans 4 puits sur 4 pour 50, 100 et 250 μg/20 mg/mL de BromAc (figure 3). Il convient de noter qu’à 105,5 TCID 50/mL, le LRV était légèrement inférieur au seuil à 3,2 en moyenne, avec 1 puits sur 4, 2 puits sur 4 et 4 puits sur 4 pour 50, 100 et 250 μg/20 mg/mL de BromAc, respectivement (tableau 1). Dans l’ensemble, l’inactivation in vitro de la capacité de réplication des deux souches de SRAS-CoV-2 a été observée d’une manière dose-dépendante, la plus fortement démontrée à 100 et 250 μg/20 mg/mL de BromAc contre 104,5 TCID50/mL de virus. Graphique 3. Matrice seuil des valeurs de réduction logarithmique 10 (LRV) de la réplication in vitro du virus 96 h après traitement BromAc sur les souches WT et ∆S SARS-CoV-2 à 5,5 et 4,5 log10TCID50/mL. Les VLR ont été calculées à l’aide de la formule suivante : VRL = (RT-PCR Ct du traitement – contrôle du virus RT-PCR Ct)/3,3; comme 1 log10 ≈ 3,3 Ct. La matrice de dégradé de couleur affiche le nombre de quadruplés par condition donnant un LRV > 4, correspondant à une inactivation robuste selon l’OMS. WT = type sauvage; ∆S = S1/S2 spike mutant. Tableau 1. Valeurs de réductionlogarithmique 10 (LRV) de la réplication in vitro du virus 96 h après le traitement BromAc sur les souches WT et ∆S SARS-CoV-2 à 5,5 et 4,5 log10TCID50/mL. Les VLR ont été calculées à l’aide de la formule suivante : VRL = (RT-PCR Ct de traitement – contrôle du virus RT-PCR Ct)/3,3 ; comme 1 log10 ≈ 3,3 Ct. Chaque répétition est décrite. TCID50/mL = dose infectieuse médiane de culture tissulaire; WT = type sauvage; ∆S = S1/S2 spike mutant. L’analyse cellulaire en temps réel a démontré une cinétique de réplication comparable pour les souches de SARS-CoV-2 WT et ∆S (Figure 4). Aucune différence significative dans la viabilité cellulaire n’a été observée entre WT et ∆S à aucun moment. À partir de 48 heures après l’infection, la viabilité des cellules WT et ∆S était significativement différente par rapport à l’infection simulée (p < 0,05). Graphique 4. Capacité de réplication du SARS-CoV-2 de WT et ∆S SARS-CoV-2 mesurée par analyse cellulaire en temps réel. Les points de données correspondent à l’analyse de l’aire sous la courbe de l’indice cellulaire normalisé (impédance électronique du RTCA établie au moment de l’inoculation) à intervalles de 12 heures. La viabilité cellulaire a ensuite été déterminée en normalisant par rapport au contrôle cellulaire correspondant. WT = type sauvage; ∆S = S1/S2 spike mutant. 4. Discussion La combinaison de bromélaïne et d’acétylcystéine, BromAc, a inhibé de manière synergique l’infectiosité de deux souches de SARS-CoV-2 cultivées sur des cellules Vero. La confirmation de la protéine et ses propriétés moléculaires dépendent de son intégrité structurelle et géométrique, qui dépend à la fois des liaisons peptidiques et des ponts disulfures. L’acétylcystéine, en tant que bon agent réducteur, tend à réduire les ponts disulfure et donc à modifier les propriétés moléculaires de la plupart des protéines. Cette propriété a été largement exploitée dans le développement de plusieurs thérapies (bronchopneumopathie chronique obstructive, maladies allergiques des voies respiratoires, mucoviscidose, pseudomyxome péritonei, etc.) Plus récemment, l’acétylcystéine a été utilisée dans le développement de thérapies pour les infections respiratoires telles que la grippe et COVID-19, où l’intégrité de la protéine de pointe est vitale pour l’infection. Un mécanisme d’action hypothétique pourrait être le déploiement de la glycoprotéine de pointe et la réduction de ses liaisons disulfure. La protéine de pointe du SRAS-CoV-2 est la pierre angulaire de la liaison du virion aux cellules hôtes et représente donc une cible thérapeutique idéale. Une action mécanique directe contre cette protéine de pointe est une stratégie de traitement différente de la plupart des médicaments antiviraux existants, qui empêche l’entrée virale dans les cellules hôtes plutôt que de cibler la machinerie de réplication. BromAc agit comme un agent biochimique pour détruire les glycoprotéines complexes. Les compétences enzymatiques multipotentes de la bromélaïne, dominées par la capacité de perturber les liaisons glycosidiques, complètent utilement Le fort pouvoir de l’acétylcystéine pour réduire les liaisons disulfure. L’analyse de la séquence d’acides aminés de la glycoprotéine de pointe du SRAS-CoV-2 a permis d’identifier plusieurs sites prédéterminés où BromAc pourrait agir préférentiellement, tels que le site S2' riche en liaisons disulfure, ainsi que trois autres liaisons disulfure dans le RBD. En parallèle, le rôle du bouclier glycosidique dans la couverture de la pointe, qui est susceptible d’être enlevée par BromAc, a été mis en évidence comme un élément de stabilisation des transitions de conformation RBD ainsi qu’un mécanisme de résistance à une réponse immunitaire spécifique. Les cellules de mammifères présentent des fonctions réductrices à leur surface qui sont capables de cliver les liaisons disulfure, et il a été prouvé que la régulation de cet équilibre thiol-disulfure a un impact sur l’internalisation de différents types de virus, y compris le SARS-CoV-2. Les protéines ACE2 et spike possèdent toutes deux des liaisons disulfure. Lorsque toutes les liaisons disulfure RBD de la protéine de pointe ont été réduites en thiols, la liaison du récepteur ACE2 à la protéine de pointe est devenue moins favorable. Fait intéressant, la réduction des liaisons disulfure ACE2 a également induit une diminution de la liaison. De plus, d’autres rapports ont suggéré que la bromélaïne seule pourrait inhiber l’infection par le SARS-CoV-2 dans les cellules VeroE6 grâce à une action sur les liaisons disulfure. Ainsi, la perte d’infectiosité du SRAS-CoV-2 observée après prétraitement par BromAc pourrait être corrélée au déploiement cumulatif des protéines de pointe et d’enveloppe, avec une réduction significative de leurs liaisons disulfure par l’acétylcystéine, démontrée in vitro. Fait intéressant, un effet similaire de BromAc a été observé contre WT et ∆S SARS-CoV-2. La principale différence dans les séquences d’acides aminés entre le SARS-CoV-2 et le SARS-CoV précédent est l’inclusion d’un site de clivage de la furine entre les domaines S1 et S2. Ce site distinct de la protéine de pointe et son rôle dans la propagation de l’hôte et l’aptitude virale est un sujet de nombreux débats [. Il convient de noter que ∆S, qui héberge une mutation dans ce nouveau site de clivage S1/S2 et modifie le motif de clivage, ne présente aucune différence apparente de capacité de réplication par rapport à la souche WT. La sensibilité légèrement accrue du ∆S au traitement au bromAc n’est donc pas due à un biais de réplication basale, mais la mutation pourrait peut-être être impliquée dans l’amélioration du mécanisme d’action de BromAc. Ces résultats suggèrent néanmoins que, à partir d’une dose seuil, BromAc pourrait potentiellement être efficace sur les souches mutantes de pointe. Cela peut être un avantage évident pour BromAc par rapport aux mécanismes immunologiques spécifiques d’une vaccination spécifique aux pointes. À ce jour, différentes stratégies de traitement ont été testées, mais aucune molécule n’a démontré un effet antiviral clair. En outre, compte tenu de l’hétérogénéité de l’issue de la maladie des patients atteints de COVID-19, la stratégie de traitement devrait combiner plusieurs mécanismes d’action et être adaptée au stade de la maladie. Ainsi, la réorientation des traitements reste une stratégie idéale contre la COVID-19, en attendant une couverture vaccinale suffisante dans le monde entier. En particulier, le développement d’un traitement précoce dirigé par voie nasale susceptible de diminuer l’infectiosité d’un patient et de prévenir la progression vers des formes pulmonaires sévères est étayé par une solide justification. Hou et al. ont démontré que le premier site d’infection est la muqueuse nasopharyngée, avec un mouvement secondaire vers les poumons par aspiration. En effet, le profil d’infectiosité des cellules des voies respiratoires a suivi l’expression du récepteur ACE2, diminuant des voies respiratoires supérieures au tissu alvéolaire. Le rapport pour ACE2 était cinq fois plus élevé dans le nez que dans les voies respiratoires distales. D’autres traitements de réutilisation en tant qu’antiseptique nasal ont été testés in vitro, tels que la povidone-iode, qui a montré une activité contre le SRAS-CoV-2. Dans la présente étude, nous avons montré le potentiel thérapeutique in vitro de BromAc contre le SARS-CoV-2 avec une dose efficace seuil de 100 μg/20 mg/mL. Comme les modèles de sécurité des voies respiratoires animales chez deux espèces n’ont montré aucune toxicité à ce jour (données non publiées), l’objectif est de tester l’administration nasale du médicament dans un essai clinique de phase I (ACTRN12620000788976). Un tel traitement pourrait aider à atténuer les infections bénignes et à prévenir l’infection des personnes régulièrement en contact avec le virus, telles que les agents de santé. Bien que nos résultats soient encourageants, il y a un certain nombre de points à considérer concernant cette démonstration. À savoir, les conditions in vitro sont fixes et pourraient être différentes de in vivo. Toute réaction enzymatique est influencée par le pH de l’environnement, et encore plus lorsqu’il s’agit de réactions redox telles que la réduction de la liaison disulfure. Le pH de la muqueuse nasale est, en termes physiologiques, compris entre 5,5 et 6,5 et augmente la rhinite à 7,2–8,3 . L’âge avancé, souvent rencontré dans les infections symptomatiques du SARS-CoV-2, induit également une augmentation du pH de la muqueuse nasale. Une telle variation, en fonction des modifications généralement induites par une infection virale, peut remettre en question l’efficacité de notre stratégie de traitement. D’autres expériences in vitro pour tester diverses conditions de pH sont en cours, mais en fin de compte, seules les études cliniques seront en mesure d’évaluer ce point. Nos expériences ont été menées sur une lignée cellulaire de rein de singe connue pour être très permissive à l’infectiosité du SRAS-CoV-2. Avec l’hypothèse ci-dessus de la rupture de l’équilibre thiol-disulfure de lyse de la protéine S, l’efficacité de BromAc sur le SARS-CoV-2 ne devrait pas être influencée par le profil de protéase membranaire. La reproduction de ce protocole expérimental avec la lignée cellulaire épithéliale pulmonaire humaine Calu-3 (ATCC® HTB-55™) permettrait d’aborder ces points, car l’entrée du virus est dépendante de TMPRSS2 et indépendante du pH, comme dans l’épithélium des voies respiratoires, tandis que l’entrée du virus dans les cellules Vero est dépendante de la cathepsine L, et donc dépendante du pH. Dans l’ensemble, les résultats obtenus de la présente étude en conjonction avec des études complémentaires sur les propriétés du BromAc et la caractérisation du SRAS-CoV-2 révèlent une forte indication que BromAc peut être développé en un agent thérapeutique efficace contre le SRAS-CoV-2. 5. Conclusions Il n’existe actuellement aucun traitement thérapeutique approprié pour le SRAS-CoV-2 précoce visant à prévenir la progression de la maladie. BromAc est en cours de développement clinique par les auteurs pour les cancers mucineux en raison de sa capacité à modifier les structures complexes des glycoprotéines. Le potentiel de BromAc sur les protéines de pointe et d’enveloppe du SARS-CoV-2 stabilisées par des liaisons disulfure a été examiné et s’est avéré induire le déploiement de protéines de pointe et d’enveloppe recombinantes en réduisant les ponts stabilisateurs disulfures. BromAc a également montré un effet inhibiteur sur le SARS-CoV-2 mutant de type sauvage et de pointe par inactivation de sa capacité de réplication in vitro. Par conséquent, BromAc peut être un agent thérapeutique efficace pour l’infection précoce par le SRAS-CoV-2, malgré les mutations, et même avoir un potentiel prophylactique chez les personnes à haut risque d’infection. Contributions de l’auteur Conceptualisation, J.A., K.P., S.J.V. et D.L.M.; méthodologie, J.A., G.Q., K.P., S.B. et A.H.M.; validation, J.A., G.Q., K.P., V.K., S.B., et A.H.M.; enquête, J.A., G.Q., K.P., V.K., S.B., et A.H.M.; rédaction – préparation de l’ébauche originale, G.Q., K.P., V.K, A.H.M., E.F. et S.J.V.; supervision, D.L.M. et E.F.; administration du projet, S.J.V.; financement d’acquisition, S.J.V. et D.L.M. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit. Financement Cette recherche est en partie financée par Mucpharm Pty Ltd., Australie. Déclaration de disponibilité des données Une prépublication de ce manuscrit a été archivée le www.biorxiv.org (consulté le 31 janvier 2021) en raison de l’urgence du COVID- 19. Conflits d’intérêts David L. Morris est le co-inventeur et le cessionnaire de la licence pour cette étude et directeur de la société sponsor spin-off, Mucpharm Pty Ltd. Javed Akhter, Krishna Pillai et Ahmed Mekkawy sont des employés de Mucpharm Pty Ltd. Sarah Valle est en partie employée par Mucpharm pour son développement du cancer et est soutenue par une bourse du programme de formation à la recherche du gouvernement australien. Vahan Kepenekian remercie la Fondation Nuovo Soldati pour sa bourse et a été en partie parrainée par Mucpharm Pty Ltd. Références Centre de ressources sur les coronavirus de l’Université John’s Hopkins. Tableau de bord COVID-19 par le Center for Systems Science and Engineering (CSSE) de l’Université Johns Hopkins (JHU). Disponible en ligne : https://coronavirus.jhu.edu/map.html(consulté le 7 février 2021). Song, Y.; Zhang, M.; Yin, L.; Wang, K.; Zhou, Y.; Zhou, M.; Lu, Y. Traitement COVID-19: Près d’un remède? – un examen rapide des pharmacothérapies pour le nouveau coronavirus. J. Antimicrob. Agents2020, 56, 106080. 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